娜塔莉亚·尤里耶夫娜·加夫里洛娃(Наталия Юрьевна Гаврилова),圣大内科学教研室助教,圣彼得堡肺病研究所神经学医师 为了寻找一种快速方便的方法来诊断小神经纤维的自身免疫性病变,圣大科学家决定通过共聚焦显微镜观察人类角膜。

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娜塔莉亚·尤里耶夫娜·加夫里洛娃,圣大内科学教研室助教,圣彼得堡肺病研究所神经学医师,与自身免疫嵌合实验室的同事一起,继续探索检测小神经纤维病变(自身免疫细胞对穿透所有内部器官和组织的细神经纤维造成的损害,由此产生各种神经系统症状)的方法。

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“健康的志愿者”:相互平行的直神经干(粗线)有少量分支(细线),朗格汉斯细胞很少(白色无定形点)。

2019 年,科学家们已研究了这种病理诊断中最常用方法——皮肤活检的潜力。“尽管皮肤活组织检查被认为是检测小神经纤维自身免疫病变的‘黄金标准’,但它也有许多缺点,” 娜塔莉亚·加夫里洛娃说。“首先,此过程涉及获取生物材料,即患者的一小块皮肤,这可能是危险的。其次,活组织检查不可能进行对照研究。因为伤口处会长出新皮肤,下次需要从其他区域取样,神经纤维的位置可能与之前部位的位置不一致。第三,这个过程需要经验丰富的,能够高质量地进行必要测试的专家。最后也是第四,该技术尚未完全标准化。也就是说,过程没有统一规则,对统一过程的观察才可以对结果做出准确判断。当然,有研究资料表明可以在脚踝皮肤上进行活组织检查。但小神经纤维的病变是分散分布的。因此,如果患者患有面部神经病变,踝关节皮肤活检未必能够检出。基于以上所有,我们需要寻找新的诊断方法。”

新方法

来自圣大的专家小组开始研究眼角膜的共聚焦显微镜检查方法。科学家们打算研究是否有可能将其用作检测小神经纤维自身免疫性病变的附加或主要方法。

眼角膜的共聚焦显微镜检查可以观察到小神经纤维的最细微变化,并且不需要侵入患者身体组织。它也是无痛的,可以重复多次。例如,可以用来追踪治疗过程的动态发展。除此以外,如果说小腿皮肤表面积很大,可能在其中一个区域发现病变,而在另一个区域没有发现,那么角膜研究人员则可以完整地看到,甚至可以评估两只眼睛角膜的状况。共聚焦显微镜方法的唯一缺点是,它不能用于量化组织中细胞因子和炎症因子的浓度,这在自身免疫过程的发展中起着重要作用。然而,在显微图像中可以很好地追踪朗格汉斯细胞(一种包含在上皮组织中的免疫细胞——编者注)。根据它们的数量,科学家可以判断炎症过程存在与否,并在必要时进行额外的分析。

使用皮肤活检诊断结节病研究的更多信息,请参阅文章

《我们的免疫力既美丽又危险》(《圣彼得堡大学学报》2019 年第 05-06

“共聚焦显微镜使用一种技术来对齐两个镜头。第一个镜片定位于活体组织上,在我们的案例中是患者的角膜。研究人员通过第二个镜头进行观察。将来自每个镜头的光束组合在一起的那一刻,我们便获得了实时 3D 图像,”研究参与者,圣大医务专业项目六年级学生玛利亚·卢卡申科(Мария Лукашенко)说,“使用共聚焦显微镜的方法,我们可以使用各

种模块,更好地看到特定物体。例如在我们的研究中,我们使用了一种特殊的视网膜模块。我们用它来研究角膜的五层图像。”

具体方法如下。首先,科学家给患者的角膜拍照。然后,根据四个主要指标进行计数:神经纤维的长度、纤维的粗细、从神经干伸出的分支数、其弯曲度和图像深度。根据结果,

研究人员得出关于小神经纤维损伤程度的结论。根据玛利亚·卢卡申科的说法,起初科学家们使用 Adobe Photoshop 放大图像,自己进行计算,这样需耗时三个小时。之后他们联系了卡塔尔康奈尔大学(Weill Cornell Medicine — Qatar)生物医学部的研究员、长期从事共聚焦眼显微镜研究的拉亚兹·马利克(Райаз Малик)教授。教授帮助圣大科学家们掌握了计算图像中小纤维数量的特殊程序,现在这一步只需要很短的时间。

“马利克教授的程序为四个主要指标中的每一个指定了系数。只需要标记所需的区域,程序就会以数字形式给出结果。当然,必须强调的是,该程序是为拥有专业技能和知识的人设计的,”娜塔莉亚·加夫里洛娃指出。“目前,马利克教授的团队正在开发一种基于人工智能的新算法。这将加快程序速度,并简化研究人员的任务。打个比方说,专家们将不再需要标记图像。”

诊断困难

科学家们正在研究患有纤维肌痛和慢性疲劳综合征的患者。在第一种病症下,人们会出现对称的肌肉骨骼疼痛。在第二种病症下,人们会感到精疲力竭和疲劳,并出现某些心血管疾病。乍一看,这些是完全不同的病理情况。然而,研究人员在工作初始阶段发现了它们之间的共通之处。小神经纤维缠绕在血管上并帮助调节组织的血液供应。此外,小纤维参与疼痛冲动的传递。由此,自身免疫细胞对它们的损伤会导致疼痛和直立症状的出现,例如通常发生在慢性疲劳综合征中的眩晕。

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“慢性疲劳综合症患者”:只可见两条神经干,它们形态弯曲,有很多分散的分支,很多朗格汉斯细胞。

“因为人类对纤维肌痛和慢性疲劳综合征知之甚少,医生不喜欢做出这些诊断。因此,患者常常从一位专科医生转到另一位专科医生处求诊,这使他们的治疗变得更加复杂。患有慢性疲劳综合症的人尤为煎熬。通常,这样的患者会接受大量的检查和研究,但所有指标都在正常范围内。不仅如此,从他们的外表来看也很难说患有某种疾病。患者并不感到疼痛,他们的抱怨仅与改变体位时的眩晕和脉搏波动有关。例如,当他们起床时,他们的心率可以增加到每分钟 120 次,娜塔莉亚·加夫里洛娃说。“因此,作为我们工作的一部分,我们还希望同时完善这两种诊断的临床标准。”根据她的说法,这也是纤维肌痛患者能够主张丧失劳动能力的必要条件:由于剧烈的疼痛,且不能总是用药物控制住,因此患者很难工作。定义这种疾病的形态学标准并规定其诊断,是将这类疾病列入的疾病列表,并认定患者丧失劳动能力的有力论据。

长期的工作

科学家计划以多种不同方式对患者进行检查。他们已使用特制的标准化问卷采访了志愿者,并准备进行皮肤活检程序和血液采样,以确定免疫能力的指标。他们还将进行其他测试,例如听力测试——测量听力敏锐度和对不同声波的敏感性,这也与小神经纤维的功能有关。如娜塔莉亚·加夫里洛娃所说,圣大科学家的研究会显着拓展眼角膜共聚焦显微镜的使用方法。原因之一是因为大学的专家们收集了数量最多的患者样本:有来自俄罗斯不同城市的大约 70 人的样本。在早期科学研究中,观察到如此多的患者是极为罕见的。

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“纤维肌痛患者”:无法区分神经干和神经纤维,只能看到分支,很多朗格汉斯细胞

“总的来说,我们希望分析皮肤活检数据与共聚焦显微镜数据的匹配程度,并将其与实验室测试结果进行比较。我们还想明确,是否可以使用显微镜作为确定小纤维神经病变的主要技术而无需进行活检,”玛利亚·卢卡申科总结道。“只要我们能够完成一半的设想,未来这项技术便可以用于诊断自身免疫性疾病。”

据她介绍,共聚焦显微镜也将有助于医生检测糖尿病患者的眼部病变。这些患者除了糖尿病视网膜病变并发症,也可能患有小神经纤维损伤和功能障碍。上述疾病具有不同的临床表征,但都可使用共聚焦显微镜检测出来。